
干细胞与再生医学是当今世界生命科学最为活跃的领域之一,一直是广州地区科研的重点发展方向。主持国家战略性先导专项、科技重大专项、重大科学研究计划等多个重大科研项目。
经过前期建设,已经购置了用于细胞观察分析的激光共聚焦显微镜和透射电镜,但是在干细胞的显微成像观察和分离、分选技术方面,配置不完善,没有长时间进行细胞观察的显微成像系统,也没有快速无菌分选的流式细胞分选系统;在干细胞临床前研究方面,缺少干细胞体外大规模培养、扩增和定向诱导分化的相关设备,同时需要相关设备支撑干细胞产品储存、运输、移植等生产和应用过程。该平台在整合原有基础条件下,通过购置多激光高性能流式细胞分选仪,扫描电子显微镜系统、显微激光切割系统等关键仪器,解决研究过程中细胞观察、分析、分离等技术难题,同时通过对神经退行性疾病、白血病、地中海贫血、肿瘤等病人建立疾病特异的iPS细胞模型,利用疾病特异的细胞进行药物筛选和毒理测试,得到病人特异的安全、有效药物,指导临床治疗。干细胞与再生医学技术平台将建成在干细胞和再生医学领域集基础研究、技术研发、临床治疗和技术咨询为一体的技术支撑系统。
目前广州区域中心干细胞尤其是在诱导多能干细胞的技术和机理研究有一支实力雄厚的研究队伍,形成了一系列重大成果:2007年,率先在中国建立诱导多能干细胞(IPS)体系;2008年,在国际上首次获得猪iPS细胞;2009年,首次发现维生素C具有显著提高多能干细胞诱导效率;2010年,揭示了形成诱导多能干细胞重编程过程的启动机制,被《科技日报》评为2010年我国十大科技新闻;2011年,破解了维生素C能促进体细胞“变身”为诱导多能干细胞的分子机制,2010年,“诱导多能干细胞机理与技术研究”获得广东省科技进步一等奖,2013年,《干细胞多能性与重编程机理研究》获自然科学奖二等奖。这一系列重要成果使广州区域中心成为一支推进我国诱导干细胞发展的核心力量。
代表性仪器:
1.双光子激光共聚焦显微镜
双光子激光共聚焦显微镜结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术,主要用于细胞及生物荧光样品的观察与分析。应用范围包括多色荧光成像、3D立体重构、时间动态记录、荧光能量共振转移、荧光漂白/激活实验、钙离子检测、厚组织样品深层荧光探测、二次谐波成像等。广泛应用于形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域。
细胞免疫荧光流程
1) 20×20盖玻片清洗干净后,无水乙醇浸泡过夜,载玻片置于无水乙醇中浸泡,待用;
2) 爬片;目标细胞(如:转染24h的细胞)胰酶消化后,用新鲜培养基吹打悬浮;取出盖玻片,酒精灯火焰灼烧至乙醇
燃烧干净,盖玻片平放在6孔板内,接种细胞至六孔板,5%CO2培养箱37C培养24h,细胞贴附在盖玻片上。
3) 收片;细胞贴附24h后,去除培养基,加入预冷PBS洗片,重复一次。
4) 固定;加入1ml预冷的4%多聚甲醛,覆盖盖玻片,冰上孵育10-15min,PBS洗片3次。
5) 透化;加入0.5ml遇冷的0.5%Triton-100,冰上孵育5min,PBS洗片3次,吸尽表面液体。
6) 封闭;常温下,加入2ml 含10%FBS的PBS,孵育1h,PBS洗片1次。
7) 一抗孵育;稍晾干盖玻片,加入100ul稀释好的一抗,室温孵育2h,PBS洗涤3次。
8) 二抗孵育;同上
9) 染核;加入0.5ml DAPI工作液(1ug/ml,PBS稀释),覆盖盖玻片,室温孵育5min。
10)封片;PBS洗片三次后,晾干,同时晾干载玻片后,滴上30ul封片剂,盖上盖玻片,待观察。
2.透射电子显微镜(FEI Tecnai G2 Spirit)
透射电子显微镜,是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上,电子与样品中的原子碰撞而改变方向,从而产生立体角散射。透射电子散射角的大小与样品的密度、厚度相关,因此可以形成明暗不同的影像,影像将放大、聚焦后在成像器件(荧光屏、胶片或CCD)上显示出来。Tecnai G2透射电子显微镜加速电压为120kV,配有同步数据记录、嵌入式 STEM、CCD 相机、精密的高倾角 (± 70°) 旋转样品杆、三维重构数据采集软件、蒙太奇软件。
主要用于生物样品及材料形貌及内部结构观察,应用范围主要包括1). 病毒、生物大分子、细胞器、纳米材料等颗粒物观察;2). 细胞及组织亚细胞结构分析;3). TEM/STEM三维重构;4. 免疫电镜等。
3.流式技术应用-超高速分选系统 MoFlo Astrios
MoFlo Astrios是一套6路流式细胞分选系统,具有精确的荧光检测技术和免微珠分选功能,能够满足多种分析需求,并具备高精度高活性的流式细胞分选功能,其流路设计具备高速、长时间无值守分选和断点自动监测的分选保护功能.
1.免疫学研究
通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析,进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。有大量文献记载了淋巴细胞亚群等在各种疾病中的变化。正常人群淋巴细胞T4/T8比值大约为2∶1,但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用流式技术还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应,如果T4/T8比例倒置,病人预后良好,较少发生肾排异现象;反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于艾滋病的诊断和治疗中。还有研究记载了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值,并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了研究。

2.细胞周期分析
流式检测细胞周期,是在临床医学中应用于肿瘤检测的一种有效手段。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期,S期和G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。
3. 细胞凋亡检测
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分。

4.细胞增殖分析
荧光染料CFSE(CFDA-SE),是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料,能够轻易穿透细胞膜,在活细胞内与胞内蛋白共价结合,水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中,它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减,标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半,根据这一特性,它可被用于检测细胞增殖,细胞周期的估算及细胞分裂等方面。另外,CFSE标记的细胞用于体内观察可以长达数周之久,它常被用来做活体细胞检测实验和用荧光电镜观察细胞长期活动的实验。荧光探针CFSE进入细胞后定位于细胞膜、细胞质和细胞核,在细胞核的荧光染色最强,并证实CFSE不影响细胞的增殖能力。利用流式检测CFSE在细胞中的强弱分析细胞增殖方法简单,且不用放射性同位素,不存在安全隐患。可以更快速,更准确和更安全的得到想要的实验数据。

5. 细胞分选
当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中,被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液,在鞘液的包裹和推动下,细胞被排成单列,以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷,当液滴流经过带有几千伏的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,没有充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。
流式细胞分选系统主要应用于: 1)干细胞组织工程研究;2)细胞增值、活性和凋亡研究;3)疾病细胞如炎症细胞、肿瘤细胞等的发生、发展和转归研究;4)基因表达和表达调控研究;5)细胞内信号传导和生物大分子间相互作用研究;6)各种病原体如病毒、细菌等基础和致病性和致病机理研究;7)药理药效和药物开发研究;8)移植和细胞治疗研究;9)生物材料对细胞结构、活性和功能的影响等。利用仪器的分选功能分选得到高纯度、高活性的稀有细胞,通过直接培养、诱导、增殖、分化、活化和移植等进行更深一步的细胞功能和细胞治疗探索,还可以在此基础上逆向进行基因组合蛋白质组相关研究,寻找致病基因、致病蛋白和疾病信号传导方式。


